浙江大学工程改造毕赤酵母完成长春质碱的从头组成

　　报导了长春碱前体（长春质碱和文多灵）从头组成的突破性效果之后，浙江大学连佳长课题组在宣布研讨论文，初次报导了利用毕赤酵母细胞工厂来高效组成长春质碱。长春质碱和文多灵可偶联组成临床使用最为有用的抗癌药物长春碱。但是，这些植物来历次级代谢产品的天然含量低、结构较为杂乱，阻止了其大规模的植物提取或化学组成，导致产值低、本钱高。本研讨以毕赤酵母为底盘细胞重构长春质碱组成途径，完成了从简略碳源到高的附加价值天然产品的从头组成（图1）。

　　首要，在毕赤酵母基因组上挑选得到了31个整合位点，以赤色荧光蛋白基因为报告基因，测验了各个整合位点的整合功率，并对具有高整合功率的整合位点进行了表达强度测验、稳定性剖析和成长剖析。31个整合位点中有24个整合位点的整合功率到达了80%以上，且荧光强度和位点存在相关性（图2）。在非选择性培育基中接连搬运30代后，一切菌落均出现赤色荧光，标明异源基因表达盒在毕赤酵母基因组的稳定性。此外，对多重基因组整合功率进行了评价，三位点一起整合的功率高于60%。

　　考虑到长春质碱组成途径的杂乱性，将其分红三个功能模块（CAN模块、STR模块和NPT模块）进行重构和优化。首要，重构了CAN模块（CAN4A），在外源添加异胡豆苷的条件下，长春质碱的产值为125 g/L（图3A和3B）。CrPAS是CAN模块的要害蛋白，将其与MBP交融表达能有用进步长春质碱的产值（MBP3-tPAS），到达270 g/L（图3C）。因为缺少途径中绝大部分中间体的检测的新方法，经过添加CAN模块基因的复制数来判定途径的限速酶，能得出SGD、GS、PAS、DPAS和CS为途径的首要限速酶。在基因组上添加这些限速酶基因的复制数，得到菌株CAN7，当体外添加4.5 mg/L异胡豆苷时，长春质碱的产值可达1.1 mg/L（图3D）。

　　在菌株CAN7的基础上，引进STR模块得到菌株CAN9（图4A）。在外源添加150 mg/L荆芥醇时，长春质碱的产值为1.2 mg/L。经过添加STR模块基因的复制数，发现CrSTR和CrSLS是首要限速酶，添加其复制数（CAN11），长春质碱的产值为2.7 mg/L（图4B）。

　　在菌株CAN11的基础上，引进NPT模块得到菌株CAN14（图5A），长春质碱的产值仅为1.6 g/L。在菌株CAN14中引进MLPL（乳胶蛋白类基因），额定引进由组成型启动子驱动的CrG8H和CrGES-ScERG20WW，过表达转录激活因子MXR1，构建得到菌株CAN17，长春质碱的产值进步到20.3 g/L（图5B）。当甲醇作为仅有的碳源和动力时，超越70%的碳代谢通量流向了异化途径（生成能量和二氧化碳），而不是同化途径（生物组成），因而测验引进非按捺性碳源，发现甲醇与海藻糖或甘露醇共培育时，长春质碱的产值能大大的进步到65 g/L（图5C）。

　　最终对底盘细胞做改造。过表达酿酒酵母来历的腺苷甲硫氨酸合酶进步SAM供给，可进步长春质碱产值～2倍（CAN18A）。过表达CYB5进步P450的电子传递功率，使长春质碱的产值进步～1.7倍（CAN18B）。将这些代谢工程改造战略结合起来构建CAN19，其长春质碱的产值进步了～6倍（图6A），在1 L发酵罐中进行补料分批发酵，产值可达2.57 mg/L（图6B）。

　　以异胡豆苷和荆芥醇作为节点，将长春质碱组成途径分红三个功能模块，在毕赤酵母内分模块顺次进行整合和优化，初次在毕赤酵母完成了长春质碱的从头组成。构建的毕赤酵母工程菌株 CAN19在摇瓶和发酵罐上的产值分别为0.38 mg/L和2.57 mg/L。长春质碱途径是迄今为止在非形式菌株中构建的最为杂乱的生物组成途径，证明了毕赤酵母作为组成植物天然产品细胞工厂的优势和潜力。

　　本研讨得到了国家重点研制方案（2018YFA0901800和2021YFC2103200）、国家自然科学基金（22278361）和浙江省杰出青年基金（LR20B060003）等项目的支撑。（来历：科学网）